HPG/AHA蛋白合成分析方案熒光顯微鏡

介紹

L-高炔丙基甘氨酸（HPG）和L-疊氮高丙氨酸（AHA）是傳統(tǒng)35S蛋氨酸的非放射性替代品，后者在活性蛋白質合成過程中被并入蛋白質中，可以直接添加到細胞中。用于檢測從頭合成蛋白的基于HPG和AHA的商業(yè)試劑盒提供了很好的結果，但通常非常昂貴，并且提供了固定量的試劑，這限制了這些試劑盒的優(yōu)化或非協(xié)議使用。自組裝套件是商用套件的可行替代品，尤其是當所有組件都可從許多供應商處廣泛獲得時。試劑的量和點擊反應條件在許多商業(yè)試劑盒之間非常相似，并且符合大量已發(fā)表的基于HPG和AHA的新合成蛋白質檢測程序。使用所提供的方案，研究人員將能夠組裝HPG或AHA蛋白質合成測定，這將需要很少的微調（如果有的話）。

這些具有改進的生物相容性和檢測極限的試劑盒首先由賽默飛世爾科學公司商業(yè)化，并以Click iT®HPG和Click i T®AHA的價格出售。Click Chemistry Tools工具包利用了下一代銅螯合疊氮化物。在疊氮化物報告分子處引入銅螯合部分允許顯著增加反應位點處的有效Cu（I）濃度，增強了反應速率加速中的最弱環(huán)節(jié)，大大提高了用于分析細胞中蛋白質合成的基于HPG和AHA的測定的靈敏度和生物相容性。

所需材料

HPG（L-炔丙基甘氨酸）或AHA（L-氮雜高丙氨酸）

AZDye吡啶疊氮化物

五水合硫酸銅（II）

THPTA公司

抗壞血酸鈉

固定劑（PBS中3.7%甲醛）

滲透試劑（例如，0.5%Triton®X-100 PBS溶液）

PBS中的3%BSA（pH 7.4）

Hoechst 33342（可選）

材料準備

HPG/AHA儲備溶液制備50 mM HPG或AHA在DMSO或水中的溶液，例如使1 mL 50 mM儲備溶液溶解8 mg HPG或9 mg AHA在1 mL DMSO中或水中

AZDye Picolyl Azide儲備溶液在DMSO或水中制備1mM溶液。示例：要制備150µL，將整個AZDye Picolyl Azide試劑盒溶于150µL DMSO或水中

銅催化劑（25 mM CuSO4，62.5 mM THPTA）溶液稱出312 mg五水合硫酸銅（II）和1.35 g THPTA，加入50 mL水，渦旋至溶解

反應緩沖液50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5。將3.02 g Tris，4.4 g NaCl溶于500 mL水中，調節(jié)pH至7.5，無菌過濾器

Hoechst 33342 10 mg/mL儲備溶液。將1 mg Hoechst 33342溶解在100µL去離子水中

還原劑將20 mg抗壞血酸鈉溶于1.8 mL去離子水中。渦旋直至溶解?？箟难徕c溶液易被氧化。我們建議始終使用新鮮制備的抗壞血酸鈉溶液

在PBS中洗滌緩沖液0.5 mM EDTA、2 mM NaN3。向1 L PBS中加入1 mL 0.5 M EDTA和0.13 g干燥die氮化鈉。用于長期儲存的無菌過濾器

1.用HPG/AHA標記細胞

該方案基于大量基于HPG和AHA的程序的出版物，用于分析與不同類型細胞一起使用的細胞中的肽合成。優(yōu)化的HPG/AHA濃度為50μM，但可能需要根據(jù)給定的細胞類型進行調整。生長培養(yǎng)基、細胞密度、細胞類型變化和其他因素可能會影響標記。鼓勵研究人員首先確定HPG試劑的最佳濃度以及每種細胞類型的標記時間。

將細胞以所需的密度放置在蓋玻片上，并在額外處理前讓其恢復過夜

在DMSO或水中制備50 mM HPG或AHA溶液

用PBS清洗細胞一次，加入無蛋氨酸培養(yǎng)基，并在37°C下孵育細胞30–60分鐘，以耗盡蛋氨酸儲備

將所需量的HPG或AHA添加到無L-蛋氨酸培養(yǎng)基中的細胞中，以達到最佳工作HPG/AHA濃度（50μM，如果未優(yōu)化）

在培養(yǎng)的細胞中加入HPG或AHA時，避免以可能破壞正常細胞循環(huán)模式的方式干擾細胞

在適合細胞類型的條件下培養(yǎng)細胞所需的時間。不同的細胞類型可能需要不同的孵育期，以便用HPG或AHA進行最佳標記。作為起點，我們建議50μM HPG或AHA持續(xù)1小時

立即進行細胞固定和滲透

2.細胞固定和滲透

以下方案用于在PBS中使用3.7%甲醛的固定步驟，然后進行0.5%Triton®X-100滲透步驟。也可以使用使用其他固定/滲透試劑（如甲醇和皂苷）的方案。

將每個蓋玻片轉移到一個井中。為了方便加工，使用6孔板

代謝標記后，移除培養(yǎng)基，向每個含有蓋玻片的孔中加入1 mL PBS中的3.7%甲醛。室溫下孵育15分鐘

去除固定劑，用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個孔中的細胞兩次

取出洗滌液。向每個孔中加入1 mL 0.5%Triton®X-100 PBS溶液，然后在室溫下孵育20分鐘

3.HPG/AHA檢測

注：每個蓋玻片使用500μL反應混合物。只要剩余的反應組分保持在相同的比例，可以使用較小的體積。

根據(jù)表1制備所需量的反應雞尾酒。按表中所列順序添加配料。在制備后15分鐘內使用反應混合物。

表1

移除滲透緩沖液（步驟2.4）。用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個孔中的細胞兩次。取出洗滌液。

向每個含有蓋玻片的孔中加入0.5mL反應雞尾酒。短暫搖動盤子，確保反應混合物均勻分布在蓋玻片上。

避光，在室溫下孵育板30分鐘

取出反應混合物。用PBS中的1mL 3%BSA洗滌每個孔一次。取出洗滌液。

用1mL洗滌緩沖液洗滌每個孔一次。取出洗滌液。

用1mL PBS洗滌每個孔一次。取出洗滌液。

此時，樣本已準備好進行DNA染色。如果不需要DNA染色，繼續(xù)進行成像

如果需要對樣品進行抗體標記，請按照制造商的建議進行標記。培養(yǎng)過程中，保持樣品免受光照。

4.DNA染色

用1mL PBS清洗每個孔。取出洗滌液。

通過稀釋Hoechst 33342 1:2000的儲備溶液制備1x Hoechs 33342溶液。1x Hotechst 33332溶液的最終濃度為5µg/mL。

1x Hoechst 33342的最終濃度范圍為2μg/mL至10μg/mL。

每孔添加1 mL 1x Hoechst 33342溶液。防止光線照射。在室溫下孵育30分鐘。

移除Hoechst 33342溶液。

用1mL PBS洗滌每個孔兩次。

取出洗滌液。

成像

標記細胞與所有載玻片制備方法兼容

所選引用：

Dieterich，D.C.、Link，A.J.、Graumann，J.、Tirrell，D.A.和Schuman，E.M.等人（2006）。使用生物正交非經(jīng)典氨基酸標記（BONCAT）選擇性鑒定哺乳動物細胞中新合成的蛋白質。美國國家科學院院刊，103（25），9482-87。[PNAS]