一、實(shí)驗原理

ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體—聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

二、實(shí)驗材料

1、試劑

(1)包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

NaCO3：1.59克、NaHCO3：2.93克，加蒸餾水至1000ml

(2)洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M　KH2PO4 0.2克　Na2HPO4·12H2O　2.9克　NaCl  8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml

(3)稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克　加洗滌緩沖液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10%使用。

(4)終止液(2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。

(5)底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸)：0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml　0.1M 檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml　加蒸餾水50ml。

(6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩沖液(PH5.5) 10ml 0.75% H2O232μl

(7)ABTS使用液：ABTS　0.5mg　底物緩沖液(PH5.5) 1ml　3% H2O2　2μl

(8)抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

(9)正常人血清和陽性對照血清。

2、器材:

(1)聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

(2)小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3)4℃冰箱，37℃孵育箱。

三、實(shí)驗步驟

（一）用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1、包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3、加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4、加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5、終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6、結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

（二）用于檢測未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時，洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌，后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

四、注意事項

1.正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2.在ELISA中，進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

(1)固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

(2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。

(3)酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

(4)酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。