熒光是光致發(fā)光的一種發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某些物質(zhì)受到光、電、磁、化學(xué)能激發(fā)時(shí)，電子吸收能量并從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的電子不穩(wěn)定。它將通過(guò)輻射躍遷和非輻射躍遷回到基態(tài)。輻射躍遷的衰變過(guò)程伴隨著光子的發(fā)射，產(chǎn)生熒光和磷光。非輻射躍遷包括振動(dòng)弛豫、內(nèi)部轉(zhuǎn)換和系間跨越。非輻射躍遷會(huì)造成能量損失，發(fā)射光子的能量一般小于吸收光子的能量。因此，熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜波長(zhǎng)通常大于吸收光譜波長(zhǎng)。

一 熒光探針需要滿足的條件

1.易于合成和純化，收率高，安全無(wú)毒。

2.穩(wěn)定性和溶解性好，特別是脂溶性透膜性好。

3、通過(guò)物理化學(xué)作用與標(biāo)記物質(zhì)特異性結(jié)合，標(biāo)記條件溫和。殘留物和副產(chǎn)物很容易去除。

4.熒光量子產(chǎn)率高，摩爾消光系數(shù)大，抗漂白能力強(qiáng)。熒光與背景形成鮮明對(duì)比。此外。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)可以有效避免細(xì)胞自發(fā)熒光的背景干擾。

二 近紅外（NIR）熒光探頭的優(yōu)點(diǎn)

1、近紅外光檢測(cè)樣品穿透力強(qiáng)、成像分辨率高、檢測(cè)靈敏度高、信噪比高。

2.在可見(jiàn)光區(qū)域，生物組織的某些成分會(huì)自激發(fā)產(chǎn)生自發(fā)熒光。并且樣品的散射光強(qiáng)度較高，嚴(yán)重干擾熒光檢測(cè)和成像追蹤。近紅外熒光自發(fā)熒光背景低。

三 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性小分子（RSM）的NIR方法

細(xì)胞中的RSM往往壽命短、反應(yīng)活性高、濃度極低、對(duì)環(huán)境敏感且不發(fā)出熒光。因此，必須借助熒光探針的特異性捕獲標(biāo)記才能具有近紅外熒光特性。

四 熒光探針廣泛應(yīng)用于生物大分子研究的原因

分子熒光探針廣泛用于研究蛋白質(zhì)和其他生物大分子接觸表面的表面誘導(dǎo)構(gòu)象變化。在直接分析方法中，熒光分析方法應(yīng)用廣泛，且優(yōu)于間接分析方法，因?yàn)樗黄茐慕Y(jié)合平衡，接近反應(yīng)的真實(shí)存在。

五熒光探針作為光敏劑藥物的能量供體

熒光納米探針不僅可以作為藥物載體與光敏藥物分子結(jié)合形成多功能納米材料，還可以作為光敏藥物分子的能量供體，提高其單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。

光敏劑和熒光染料的吸收光譜、熒光發(fā)射光譜重疊較少。有效避免分子間能量轉(zhuǎn)移引起的熒光猝滅、單線態(tài)氧生成效率降低、熒光成像等。在熒光成像的同時(shí)，光敏劑強(qiáng)制激發(fā)產(chǎn)生的單線態(tài)氧也可能與激發(fā)態(tài)發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。熒光探針并引起熒光猝滅?；蛘咚赡軙?huì)暴露量子點(diǎn)在成像過(guò)程中潛在的毒副作用。因此，設(shè)計(jì)合適的納米載體結(jié)構(gòu)將光敏劑藥物分子與熒光探針物理隔離是避免此類光化學(xué)反應(yīng)的有效方法。

六、熒光分子探針的組成及功能

1.受體

它選擇性地與物體（分析物）結(jié)合并引起探針?biāo)诘幕瘜W(xué)或生物微環(huán)境的變化。

2.熒光團(tuán)

識(shí)別基團(tuán)與分析物結(jié)合而引起的化學(xué)或生物微環(huán)境變化，轉(zhuǎn)化為儀器易于感知（顏色變化）或可檢測(cè)的信號(hào)。

小分子熒光探針一般采用有機(jī)小分子熒光團(tuán)，包括蒽、香dou素、熒光素、BODIPY、萘二甲酰亞胺、羅丹明、花青等。其衍生物的發(fā)射波長(zhǎng)范圍幾乎覆蓋所有可見(jiàn)光區(qū)域（400-800 nm）。并且通過(guò)對(duì)這些熒光團(tuán)進(jìn)行適當(dāng)修飾，可以實(shí)現(xiàn)藍(lán)、綠光到紅光和近紅外光（650-900 nm）的覆蓋。此外，發(fā)光量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米材料、高分子聚合物熒光材料、熒光蛋白等也可作為熒光探針中的信號(hào)基團(tuán)。

3.墊片

連接熒光基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)，有效地將識(shí)別信息轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，如熒光強(qiáng)度的變化、熒光光譜的移動(dòng)、熒光壽命的變化等。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)治療檢測(cè)對(duì)象的有效檢測(cè)。并非所有探針都有連接基團(tuán)。

七 熒光探針可檢測(cè)生物體物質(zhì)

1.質(zhì)子(H+)。

2.自由基和其他活性氮和氧物種（ROS、RNS）。

3.氣體信號(hào)分子（NO、CO、H2S……）

4.重金屬污染（Cd2+.Hg2+.Pb2+…）

5.陰離子(Cl-, HCO3-, H2PO4-, HPO42-...)

6.過(guò)渡金屬離子(Fe2+/Fe3+, Zn2+, Cu+/Cu2+…)

7.堿金屬和堿土金屬離子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+…）

8.DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子。

9、有機(jī)小分子如肽、葡萄糖、麥芽糖等。

八、熒光探針的種類

根據(jù)與客體相互作用后熒光信號(hào)的變化，可分為強(qiáng)度變化型熒光探針和比例計(jì)型熒光探針。強(qiáng)度變化型熒光探針?lè)譃殁缧停∣N-OFF）和增強(qiáng)型（OFF-ON）熒光探針。

強(qiáng)度變化型熒光探針根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)客體物種的檢測(cè)。由于熒光強(qiáng)度還受到探針濃度、激發(fā)光源效率、探針?biāo)幁h(huán)境等因素的影響，此類探針在客體物種的定量檢測(cè)中也存在明顯的局限性。目前，大多數(shù)熒光探針都是增強(qiáng)型熒光探針。

比率熒光探針本身也發(fā)射一定波長(zhǎng)的熒光。其明顯的優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)兩個(gè)波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度的比值來(lái)消除大部分環(huán)境因素的干擾，從而實(shí)現(xiàn)在探針濃度未知的情況下對(duì)被測(cè)物種的定量檢測(cè)。

九 熒光探針的設(shè)計(jì)機(jī)理

傳統(tǒng)的分子探針設(shè)計(jì)原理包括光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）、金屬配體電荷轉(zhuǎn)移（MLCT）、電子能量轉(zhuǎn)移（EET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） ）、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）、激發(fā)態(tài)準(zhǔn)分子/激基復(fù)合物形成等。新興機(jī)制包括聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）、上轉(zhuǎn)換發(fā)光（UCL）等。

十 光電子轉(zhuǎn)移（PET）

一般來(lái)說(shuō)，光致電子轉(zhuǎn)移（PET）工藝分為兩種類型。一種是電子從電子供體轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)（電子受體），激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)被還原而引起熒光猝滅。另一種是電子從激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)（電子供體）轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)（電子受體）。電子受體、激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)被氧化導(dǎo)致熒光猝滅。當(dāng)物體未結(jié)合時(shí)，熒光團(tuán)和受體之間的 PET 將淬滅熒光。物體結(jié)合后，PET 過(guò)程受到抑制，熒光團(tuán)發(fā)出熒光。

十一、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移也稱為光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移（PCT），也是設(shè)計(jì)比例熒光探針的重要方法。這類熒光探針的識(shí)別基團(tuán)直接與熒光團(tuán)相連，也可以理解為組成熒光團(tuán)的某些原子或基團(tuán)直接參與客體的識(shí)別。

十二 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是能量轉(zhuǎn)移（ET）的一種。能量轉(zhuǎn)移是指分子中能量從供體發(fā)色團(tuán)向受體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。 FRET 效率通常通過(guò)調(diào)整光譜重疊程度和供體-受體距離來(lái)改變。

十三激發(fā)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）

ESIPT現(xiàn)象是指化合物分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后質(zhì)子通過(guò)分子內(nèi)氫鍵轉(zhuǎn)移到分子中相鄰的N、S、O雜原子上，形成相應(yīng)互變異構(gòu)體的過(guò)程。

十四準(zhǔn)分子/激基復(fù)合物形成

準(zhǔn)分子（Er）可以定義為由相同結(jié)構(gòu)的激發(fā)熒光團(tuán)和基態(tài)熒光團(tuán)相互作用形成的締合體。同樣，如果處于激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)和處于基態(tài)的具有不同結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)形成復(fù)合物，則稱為激發(fā)態(tài)復(fù)合物。