酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA或ELASA）是指將可溶性抗原或抗體與聚苯乙烯等固相載體結(jié)合，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性定量檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是免疫學(xué)中的經(jīng)典實驗。

酶聯(lián)免疫吸附測定原理

1971年，Engvall和Perlmann發(fā)表了用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）定量測定IgG的文章，使1966年開發(fā)的用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)被用于液體中微量物質(zhì)的檢測樣品。測試方法。
這種方法的基本原理是：
①將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體的表面并保持其免疫活性。
②抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標(biāo)抗原或抗體，既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。
測量時，待測樣品（其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按照不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物通過洗滌與其他物質(zhì)分離，與固相載體結(jié)合的酶量與標(biāo)本中被測物質(zhì)的量成正比。加入酶反應(yīng)的底物后，底物在酶的催化下變成有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物的量與樣品中被測物質(zhì)的量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)其進(jìn)行定性或定量分析。到顏色反應(yīng)的深度。由于酶的催化效率高，可以大大放大反應(yīng)效果，使測定方法達(dá)到高靈敏度。

酶聯(lián)免疫吸附測定分類

常用的ELISA可分為以下五類：①直接ELISA； ②間接ELISA； ③夾心ELISA； ④競爭性ELISA； ⑤競爭性抑制ELISA。其他 ELISA 屬于或源自這五種 ELISA 的組合。

1.直接ELISA

其方法是將抗原按一定比例稀釋后包被于固相載體上，然后加入稀釋后的特異性酶標(biāo)抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。直接ELISA的操作非常簡單，步驟也比較簡潔，但其應(yīng)用范圍仍然很有限。一個重要原因是這種ELISA只經(jīng)過一步信號放大（酶放大），因此其靈敏度不是很高；另外，其測定的對象也很有限，只能測定酶標(biāo)記的分子。

2. 間接ELISA

間接ELISA與直接ELISA的區(qū)別在于，間接ELISA中非酶標(biāo)抗體與包被抗原結(jié)合，并引入了二抗（即二抗）。二抗是酶標(biāo)的，可以與一抗特異性結(jié)合，最后加入底物顯色并解讀結(jié)果。由于二抗一般為多克隆抗體，一個一抗分子可以結(jié)合多個二抗分子，同時一個二抗分子可以標(biāo)記多個酶分子，所以當(dāng)待測抗體為多克隆抗體時，信號經(jīng)過兩步放大，最終提高了檢測的靈敏度。此外，由于二抗的制備相對容易，并且很早就開始商業(yè)化，因此操作人員不需要進(jìn)行一抗的酶標(biāo)記，這大大減少了工作量。在檢測抗體效價、血清效價以及篩選單克隆抗體的過程中，間接ELISA是一個非常重要的實驗過程。在臨床診斷中，間接ELISA也是檢測標(biāo)記抗體的重要手段。間接ELISA也是檢測標(biāo)記抗體的重要手段。間接ELISA也是檢測標(biāo)記抗體的重要手段。

3. 三明治 ELISA

夾心ELISA一般可分為直接夾心ELISA和間接夾心ELISA兩種。
直接夾心ELISA分為雙抗體夾心ELISA和雙抗原夾心ELISA。
雙抗體夾心ELISA的方法是將一抗（捕獲抗體）包被于固相載體上，封閉后加入待檢測抗原，孵育后加入二抗（檢測抗體）。捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單克隆抗體，或者是針對相同抗原的一種單克隆抗體和一種多克隆抗體，但檢測抗體需要用酶標(biāo)記。
雙抗原夾心ELISA的原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同。
對于雙抗體夾心ELISA，待測物必須包含兩個或多個表位，否則檢測抗體無法與待測抗原結(jié)合。例如，雙抗體夾心ELISA無法檢測半抗原和小分子抗原。對于雙抗原夾心ELISA，操作與間接ELISA基本相同，但使用特異性抗原代替酶標(biāo)二抗，因此特異性比間接法更好。另外，由于間接ELISA中使用的二抗一般只識別IgG，而雙抗原夾心ELISA中可以檢測任何類似的免疫球蛋白，因此雙抗原夾心ELISA也比間接ELISA更靈敏。
間接夾心 ELISA 是基于來自兩個不同物種的抗體的夾心 ELISA。洗滌后，加入另一種種屬特異性抗體（非酶標(biāo)，作為檢測抗體），最后加入酶標(biāo)二抗（特異性識別檢測抗體），然后加入底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比，間接夾心ELISA引入了特異性識別檢測抗體的酶標(biāo)二抗，相當(dāng)于對整個系統(tǒng)的信號進(jìn)行了一步放大系統(tǒng)，因此最終結(jié)果比直接雙抗體夾心 ELISA 更靈敏。 。同時，由于間接夾心ELISA中酶標(biāo)二抗只能識別檢測抗體，而不是捕獲抗體，系統(tǒng)的特異性也得到了保證。

4. 競爭性 ELISA

該方法首先將特異性抗體吸附在固相載體表面，洗滌后分為兩組：一組加入酶標(biāo)抗原與待測抗原的混合物；一組加入酶標(biāo)抗原與待測抗原的混合物。另一組只加入酶標(biāo)抗原，孵育、洗滌后加入底物顯色，兩組底物降解量之差即為待測定的未知抗原量。用這種方法測定的抗原只需具有一個結(jié)合位點。因此，該方法常用于激素、藥物等小分子抗原的測定。

5. 競爭性抑制 ELISA

將抗原預(yù)包被于固相載體上，實驗時加入稀釋后的待檢測抗原（或抗體），然后依次加入該抗體對應(yīng)的特異性抗體和酶標(biāo)二抗。待測樣品中的抗原（或抗體）與預(yù)制備系統(tǒng)中固相載體上結(jié)合的抗原（或抗體）競爭與特定抗體（或固相載體上結(jié)合的抗原）的結(jié)合。洗掉競爭性特異性抗體，最后添加底物顯色。最終的顏色結(jié)果與待檢測的抗原（或抗體）的量成反比。

實驗設(shè)計思路及基本步驟

無論哪種ELISA，其操作均由以下基本操作組成：①將抗原或抗體吸附到固相載體上； ②添加待測樣品及后續(xù)試劑； ③孵化； ④洗滌并除去游離的未結(jié)合反應(yīng)物； ⑤ 添加酶檢測底物； ⑥ 結(jié)果解釋。

三明治法

夾心法常用于檢測大分子抗原。一般操作步驟為：

將特異性抗體固定（包被）在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗體；
添加待測樣品。如果樣品中含有待測抗原，它會與塑料孔板上的抗體特異性結(jié)合；
洗掉多余的待測樣品，加入另一種對該抗原特異的一抗，與待測抗原結(jié)合；
洗掉多余未結(jié)合的一抗，加入酶聯(lián)二抗，與一抗結(jié)合；
洗掉多余的未結(jié)合二抗，加入酶底物使酶顯色，用肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。

間接法

間接方法常用于檢測抗體。一般操作步驟為：

將已知抗原固定在塑料孔板上，完成后洗去多余的抗原；
添加待測樣品。如果樣品中含有待測一抗，它會與塑料孔板上的抗原特異性結(jié)合；
洗去多余的待測樣品，加入帶酶的二抗，與待測一抗結(jié)合；
洗去多余未結(jié)合的二抗，加入酶底物使酶顯色，用儀器（ELISA讀數(shù)器）測定塑料板中的吸光度值（OD值），評價顯色終產(chǎn)物的含量，從而測定抗體被測試內(nèi)容。

競爭法

競爭法是一種不太常用的ELISA檢測機(jī)制，一般用于檢測小分子抗原。操作步驟如下：

將特異性抗體固定在塑料孔板上，完成后洗掉多余的抗體；
添加待測樣品，使樣品中的待測抗原與塑料孔板上的抗體特異性結(jié)合；
添加帶有酶的抗原，該抗原也可以與塑料孔板上的抗體特異性結(jié)合。由于固定在塑料孔板上的抗體數(shù)量有限，當(dāng)標(biāo)本中的抗原量較多時，帶有酶的抗原能結(jié)合的固定抗體就較少，即兩種抗原都競爭結(jié)合塑料孔板上的抗體，這就是所謂競爭法的由來；
用酶洗去樣品和抗原，加入酶底物使酶顯色。當(dāng)樣品中抗原的量越多時，說明塑料孔板中殘留的帶酶的抗原越少，顏色就越深。淺的。

當(dāng)需要檢測無法獲得兩種以上抗體的抗原，或者難以獲得足夠的純化抗體固定在孔板上時，一般會考慮使用競爭ELISA。

進(jìn)步

親和素是一種糖蛋白，一分子親和素可與四個生物素小分子產(chǎn)生特異的親和力，類似于抗原和抗體的親和力。它們之間的作用力是已知比較好的非共價相互作用。 20世紀(jì)80年代后，隨著生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）的發(fā)現(xiàn)，這種親和力被應(yīng)用到ELISA技術(shù)中，大大提高了后者反應(yīng)的靈敏度和特異性。生物素很容易與蛋白質(zhì)（如抗體等）共價結(jié)合。這樣，與酶結(jié)合的親和素分子與與特異性抗體結(jié)合的生物素分子發(fā)生反應(yīng)，不僅起到多級放大作用，而且遇到相應(yīng)的酶時，會因酶的催化作用而變色。底物，實現(xiàn)檢測。未知抗原（或抗體）分子的用途。

結(jié)果判定

定性測定

定性判定的結(jié)果是對待測樣品中是否含有待測抗原或抗體給出“是"或“否"的簡單回答，分別表示為“陽性"和“陰性"。 “陽性"表示樣本在檢測系統(tǒng)中出現(xiàn)反應(yīng)。 “否定"意味著沒有反應(yīng)。通過定性判斷方法也可以獲得半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其本質(zhì)仍然是定性檢測。在這種半定量測定中，樣品經(jīng)過一系列稀釋后進(jìn)行測試，產(chǎn)生陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為效價。根據(jù)滴度可以判斷樣品的反應(yīng)活性，這比通過觀察未稀釋樣品的顏色深淺來判斷強(qiáng)陽性和弱陽性更具定量意義。
在間接和夾心 ELISA 中，陽性孔比陰性孔更暗。相反，在競爭性 ELISA 中，陰性孔比陽性孔更暗。

定量測定

ELISA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)的因素較多。特別是固相載體的包被很難達(dá)到個體間的一致性。因此，在定量測定時，每批測試必須使用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)。在此條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。夾心ELISA用于測定大分子量物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線最高點吸光度可接近2.0。常采用半對數(shù)值作圖，以供試品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。將濃度值逐點連接，得到的曲線一般呈S形，頭部和尾部曲線趨于平坦，中部較為平直的部分是好的檢測區(qū)域。
小分子量物質(zhì)的測定常用競爭法，標(biāo)準(zhǔn)曲線中的吸光度與被測物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀根據(jù)試劑盒中使用的模式略有不同。注意ELISA測定標(biāo)準(zhǔn)曲線中橫坐標(biāo)為對數(shù)關(guān)系，更有利于測定體系的表達(dá)。

故障排除

1. 顏色很淺或沒有顏色

(1)底物成分漏加、底物失效、底物配制濃度計算錯誤；
（2）整個ELISA過程中存在抗原或抗體不匹配的情況；
(3)整個ELISA過程中樣品過度稀釋；
(4)稀釋系統(tǒng)錯誤，如使用含蛋白質(zhì)的試劑進(jìn)行包被。

2、全板正極

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過高，嘗試降低濃度；
(2)使用的封閉試劑不正確或未封閉；
（3）酶標(biāo)抗原或抗體與系統(tǒng)中其他試劑結(jié)合；
(4)底物被酶標(biāo)抗原或抗體污染。

3.顯色不均勻

(1)如果ELISA板存在質(zhì)量問題，重新檢查ELISA板的同質(zhì)性；
(2)在涂覆或加樣過程中，某些孔漏氣或加得少，可能是操作者不小心，或移液器漏氣；
(3)加樣時移液器內(nèi)注入過多氣泡；
（4）購買的ELISA板不正確，可能誤選其他用途的板；
(5)培養(yǎng)過程中平板疊放過厚；
（6）樣品添加或稀釋過程中試劑混合不充分，或稀釋梯度計算錯誤；
(7)洗板不當(dāng)，有的孔未充滿洗液或加洗滌劑后洗液未充分混合，或洗板過程中帶入氣泡。

4、上色太快

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過高；
(2)某種試劑濃度過高。

5、上色太慢

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過低，或標(biāo)記效率低，或標(biāo)記后影響免疫活性；
(2)試劑被污染，如HRP酶標(biāo)抗原或抗體被疊氮hua鈉污染；
(3)反應(yīng)溫度太低；
(4)底物緩沖液的pH值不正確。

6.深色背景

(1)酶標(biāo)抗原或抗體濃度過高；
(2) 抗體的非特異性結(jié)合；
（3）抗原、抗體不純；
(4)二抗的物種交叉識別。