基因編輯技術在艾滋病毒研究中展現(xiàn)出前景

用于編輯基因的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展正在改變基因工程。1 , 2與 HIV 感染等疾病過程相關的生物途徑尤其令人感興趣。3 HIV 通過感染和破壞免疫系統(tǒng)細胞，特別是對哺乳動物適應性免疫反應至關重要的 T 細胞，對免疫系統(tǒng)造成嚴重損害。不同的研究實驗室開發(fā)了 CRISPR/Cas 基因編輯模型，試圖減少 HIV 感染。

CRISPR/Cas最初被發(fā)現(xiàn)是原核適應性免疫系統(tǒng)的關鍵組成部分。 CRISPR 代表成簇規(guī)則間隔的短回文重復，它們是包含堿基 DNA 序列短重復的原核 DNA 片段。重復序列由短間隔外源 DNA 分隔開，該外源 DNA 源自原核生物（細菌和古細菌）先前暴露于質粒或噬菌體病毒。

CRISPR 與 CRISPR 相關 (CAS) 基因協(xié)調發(fā)揮作用，使原核適應性免疫系統(tǒng)能夠識別、響應和消除外源 DNA。 CRISPR/Cas基因編輯被稱為分子剪刀，因為它本質上是從原核生物基因組中剪掉外源DNA（質粒和噬菌體）。原核生物中的 CRISPR/Cas 基因編輯類似于真核生物中的 RNA 干擾或基因沉默。

原核 CRISPR/Cas 機制被用來開發(fā)一系列豐富的編輯工具，例如用于哺乳動物細胞的 CRISPR/Cas9。 CRISPR/Cas9 有兩個主要組件：Cas9 和 RNA 向導，后者通過互補核苷酸結合將 Cas9 靶向特定的 DNA 片段。 Cas9 是一種核酸內切酶，通過與向導 RNA 結合，以序列特異性方式切割雙鏈 DNA。指導 RNA 包含與目標 DNA 配對的核苷酸。

RNA 向導經過基因工程改造，可與選定的基因靶標配對，并與 Cas9 一起遞送至細胞。當 RNA 引導 Cas9 到達目標基因組序列時，它允許 Cas9 在基因組中選定的目標點切割兩條 DNA 鏈。然后可以在 Cas9 切割位點修改、插入或去除 DNA。

研究人員設計了 RNA 向導來指導 Cas9 切割含有必需基因或長末端重復序列的 HIV 病毒 DNA 的不同區(qū)域。3 CRISPR/Cas9 基因編輯可顯著抑制各種研究細胞模型中的 HIV 病毒產生和感染，包括人類多能干細胞、原代 CD4+ T 細胞和 CD4+ T 細胞系。理論上，消除感染細胞中病毒表達所必需的HIV病毒DNA或基因應該能夠滅活或消除HIV感染。

不幸的是，研究人員還在一些實驗中發(fā)現(xiàn)細胞產生了 CRISPR/Cas9 抗性突變。當 Cas9 被引導切割時，這些突變聚集在病毒位點。 Cas9 無法切割目標位點，因此 CRISPR/CAS9 攻擊無效。3 HIV 與其他病毒一樣，具有進化出對其他攻擊機制（例如人類免疫系統(tǒng)和抗病毒的藥物）的抵抗力的能力。

在另一種對抗 HIV-1 感染的方法中，CRISPR/Cas9 已被用來消除趨化因子受體 5 型 (CCR5) 的表達。4CCR5 是一種輔助受體，某些 HIV 類型需要 CCR5 才能進入 T 細胞并引起 HIV 感染。研究人員利用靶向 CCR5 的 CRISPR/CAS9 載體破壞了 CD34 陽性造血干細胞和祖細胞中的 CCR5 基因。研究人員表明，CCR-5 突變克隆保留了分化為多種造血譜系的能力，并且很少引入脫靶突變。這很重要，因為安全性是基因編輯技術重要問題。因此，有必要證明經過編輯的細胞仍然可以發(fā)揮作用，并避免意外的、可能有害的突變。 CRISPR/CAS 系統(tǒng)的成功和局限性的認識都在推動優(yōu)化策略。

重要的是，突變 CCR5 的策略已在使用鋅指核酸酶 (ZFN) 的初步臨床醫(yī)學研究試驗中成功進行了測試。 ZFN 與 CRISP/Cas 一樣，也是有前途的基因編輯分子剪刀工具，用于減少細胞中 HIV 的表達。 ZFN 是通過將 DNA 切割核酸酶結構域與鋅指 DNA 結合結構域融合而生成的。與 CRISPR/Cas 技術中使用的 RNA 向導一樣，鋅指結構域可以被設計為靶向特定的 DNA。含有 Fok1 限制性酶的核酸酶結構域是分子剪刀組件，可催化切割目標 DNA。 SB-728-T，也稱為 CCR5-ZFN，是一種研究性基因治療 ZFN 藥物（clinicaltrials.gov：NCT01543152、NCT01252641 和 NCT01044654）。

CCR5-ZFN 的機制基于 CCR5 的基因工程修飾，使 CCR5 失去功能，細胞對 HIV 感染具有更強的抵抗力。 CCR5-ZFN 試劑是從給定個體獲得的自體 T 細胞，例如 CD4+ T 細胞，通過鋅指核酸酶對 CCR5 基因進行遺傳修飾，然后重新引入宿主生物體。修改后的 CCR5 基因座可能消除 HIV 進入并感染 T 細胞的一個場所（CCR5 受體）。4 CCR5-ZFN/SB-728-T 用于研究以確定 CCR5 轉基因細胞是否能夠抵抗 HIV 感染。研究人員還渴望確定 CCR5-ZFN/SB-728-T 是否可以將自身復制到其他耐藥細胞中，并通過阻止 HIV 進入細胞來恢復受感染宿主的免疫細胞功能。

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